Brettanomyces: As células VNC são perigosas?
Desde o inicio dos anos 90 que as Brettanomyces são consideradas contaminantes das fermentações alcoólicas e, em particular, da industria enológica (Larue 1991).
O desenvolvimento destas leveduras nos vinhos conduz ao aparecimento de características olfativas geralmente descritas como animais, fenoladas, farmacêuticas, “plástico queimado” e “suor de cavalo”. Estes odores que, frequentemente, não são aceites pelos consumidores, levam a uma degradação e a uma uniformização da qualidade dos vinhos.
Os principais compostos (4-etilfenol = 4EF e 4-etilguaiacol = 4EG) que dão lugar a estas alterações olfativas e gustativas e as vías metabólicas que conduzem ao seu aparecimento nos vinhos contaminados por Brettanomyces, começaram a ser descritos a partir de 1992 por Chatonnet. Estes fenóis voláteis derivam da transformação por via enzimática dos ácidos cinâmicos, que se encontram presentes, de forma natural, na uva e no vinho (ácido p-cumárico, ferrúlico e cafeíco), em vinil-fenóis e, de seguida, em fenóis de etilo. Geralmente, considera-se o limiar olfativo destas moléculas em 400 μg/l, no entanto, estudos publicados por Bramlay et al., 2007, mostram que este limiar se encontra entre 138 μg/l e 1528 μg/l, variando em função da matriz e da relação entre as quantidades das moléculas envolvidas.
A consciencialização por parte dos profissionais perante os danos qualitativos e comerciais gerados pelo desenvolvimento destes microrganismos nos vinhos tintos, conduziu ao desenvolvimento de diversas técnicas de deteção das Brettanomyces nos vinhos.
De seguida são apresentados os três métodos analíticos específicos mais utilizados na atualidade:
- Cultura em meio nutritivo sólido e seletivo;
- Técnica de PCR quantitativa (Q-PCR), baseada nas técnicas de biologia molecular, permitindo a amplificação específica do DNA das Brettanomyces (Phister et Mills, 2003; Delaherche et al., 2004; Agnolucci et al., 2007; Tessonnière et al., 2009; Tofalo et al., 2012; Portugal et Ruiz-Larrea, 2013);
- Citometria de fluxo, associada tanto à técnica de hibridação in situ (FISH) com sondas para o RNA ribossómico 26S de Brettanomyces (Serpaggi et al., 2010), como à marcação anticorpo-antigénio (Chaillet et al, 2014).
As técnicas de citometria e Q-PCR apresentam a vantagem de serem relativamente rápidas (entre 4 a 72 horas), comparativamente à cultura em meio seletivo, com uma duração de 7 dias.
Outra diferença importante relativamente a esta última técnica, é o facto de esta permitir quantificar, não somente, as células viáveis cultiváveis, mas também, as células viáveis não cultiváveis (VNC).
Efetivamente, demonstrou-se que, em determinadas condições e especialmente depois de tratamentos de estabilização microbiológica, como a sulfitagem, as Brettanomyces podem passar a um estado “viável não cultivável”, ou seja, perdem a capacidade de se multiplicar em meio nutritivo, mantendo-se metabolicamente ativas (Agnolucci et al., 2010, du Toit et al., 2005, Serpaggi et al., 2012).
Os autores evidenciaram também que, em igualdade de condições, as leveduras VNC e as Brettanomyces que saem do estado VNC produzem uma quantidade de fenóis voláteis significativamente menor que a modalidade testemunha (Brettanomyces viáveis cultiváveis). Estes trabalhos foram realizados com um meio modelo (GAV 10%, pH 3.5) e ainda não foram realizados em condições reais (meio -vinho).
Com a finalidade de ajudar os enólogos na escolha do método de analise melhor adaptado para a prevenção da formação de fenóis voláteis e notas “animais” nos vinhos, comprometemo-nos, através deste trabalho (realizado no âmbito do grupo nacional Brettanomyces financiado pelo France Agrimer) a avaliar, na matriz vinho, a capacidade das Brettanomyces VNC produzirem fenóis voláteis.
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Fonte: Infowine
